РОЗРОБКА ТА ВАЛІДАЦІЯ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ У РЕЖИМІ РЕАЛЬНОГО ЧАСУ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ДНК ПАТОГЕННИХ ЛЕПТОСПІР

Abstract

У статті наведені результати розробки та валідації методики полімеразної ланцюгової реакції у режимі реального часу для детекції ДНК патогенних лептоспір за міжнародними вимогами. Встановлено, що розроблена праймерна система проявляє виражену гібридизаційну активність по відношенню до ДНК-матриці при 45ºС з концентрацією іонів магнію у реакційній суміші 1,5 мМ/мкл. Представлені показники визначення чутливості, межі виявлення та специфічності методики, які свідчать про можливість її застосування з метою виявлення ДНК патогенних лептоспір при діагностиці лептоспірозу в господарствах України.

В статье приведены результаты разработки и валидации методики полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для обнаружения ДНК патогенных лептоспир по международным требованиям. Установлено, что разработанная праймерная система проявляет выраженную гибридизационную активность по отношению к ДНК-матрице при 45ºС с концентрацией ионов магния в реакционной смеси 1,5 ммоль/мкл. Представленные показатели определения чувствительности, предела обнаружения и специфичности методики, которые свидетельствуют о возможности ее применения с целью выявления ДНК патогенных лептоспир при диагностике лептоспироза в хозяйствах Украины.

Currently the polymerase chain reaction (PCR) development and use are conducted for the detection of the genetical and pathological characteristics of Leptospira and leptospirosis diagnostics. Due to this method, it is possible to detect small amounts of Leptospira’s DNA in clinical and environment samples, and for identification of Leptospira cultures as well. The goal of the work was to develop and validate the DNA protocol for detection of pathogenic Leptospira by the PCR in real time and to optimize the conditions for the amplification reaction. Materials and methods. To analyze the nucleotide sequences, which encodes the outer membrane lipoprotein LipL 32 synthesis, the sites of pathogenic Leptospira genome were collected from the GenBank on-line database.